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Linearität/Amplifikationseffizienz als Funktion des prozentualen Mutationsanteils
Ziel dieser Studie war es, den Effekt einer seriell verdünnten mutationspositiven
Probe über den gesamten Messbereich des therascreen KRAS RGQ PCR Kits zu
beurteilen. Begonnen wurde dabei mit einem Aufgabe-C
von 22 bis 23.
T
Vor der Durchführung der PCR mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurde
zunächst die optische Dichte der DNA-Extrakte von den CRC-FFPE-Zelllinien und
den NSCLC-Proben gemessen. Dann wurden DNA-Stammlösungen mit einem C
T
der Kontrollreaktion von ungefähr 23 angesetzt. Die Stammlösungen wurden
zweimal jeweils mit Wildtyp-DNA seriell verdünnt, um die Wildtyp-DNA
insgesamt konstant zu halten, während der prozentuale Anteil der mutierten
DNA im Template variiert.
Es wurden DNA-Pools angesetzt, die ausreichend Material für 6 Replikate pro
Mutation enthielten. Es wurden die C
- und ∆C
-Werte für die verschiedenen
T
T
Mutationen und die verschiedenen Verdünnungen berechnet. Für den C
-Wert
T
der Mutationsreaktion vs. log
DNA-Aufgabeverdünnung wurde eine lineare
2
Regression berechnet. Die Studie zeigte, dass die Verdünnung der Mutationen
in einem Hintergrund aus Wildtyp-DNA konstanter Konzentration zu
Amplifikationseffizienzen führte, die nicht signifikant von den in der oben
beschriebenen Linearitätsstudie ermittelten Werte abwichen.
therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019
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